מערכה ראשונה
אל כנסיית סט. אנדריאה דלה ואלה שבעיר רומא, מגיע צ'זרה אנג'לוטי, אסיר שנמלט מתא המאסר שבמבצר סט. אנג'לו. שעת צהרים עתה, והכנסייה ריקה ממבקרים. אנג'לוטי, שנידון למאסר בעוון בגידה, מוצא מסתור בחדר התפילה הפרטי של משפחת אטוונטי. הוא נכנס אליו בעזרת מפתח שהשאירה לו אחותו, ושם הוא מתכונן ללבוש בגדי אישה. גם אותם הכינה מראש אחותו, המרקיזה אטוונטי.
הצייר מריו קוורדוסי חוזר לכנסייה להשלים את ציורה של מריה מגדלנה. שמש הכנסייה, המתייחס במורת רוח לצייר, מגלה למרבה התימהון, שיש דמיון רב בין הדיוקן שבציור לבין תווי פניה של אישה אלמונית הפוקדת באחרונה את הכנסייה. מתברר שאחותו של אנג'לוטי שימשה בבלי דעת כמודל לצייר.
שמש הכנסייה עוזב את המקום, ואנג'לוטי יוצא מחדר התפילה. קוורדוסי הוא ידידו של אנג'לוטי משכבר הימים, והשניים מזהים זה את זה, אלא שאין להם שהות לשיחה של ממש, כי לפתע נשמע קולה של טוסקה, אהובת קוורדוסי. אנג'לוטי חוזר למקום מחבואו, וטוסקה הקנאית מאשימה את אהובה, שבגד בה זה עתה עם אישה אחרת. קוורדוסי מצליח להפיג את חשדותיה, והם קובעים להיפגש בערב בביתו. אלא שחשדה של טוסקה מתעורר שנית, שעה שהיא מבחינה בדמיון שבין דיוקנה המצוייר של מריה מגדלנה לבין מראה פניה של המרקיזה אטוונטי, המוכרת לה. קוורדוסי מרגיע אותה ומלווה אותה החוצה.
אנג'לוטי יוצא שוב ממחבואו, וקוורדוסי מציע לו להסתתר בגן חווילתו, במקום מסתור בתחתית הבאר. קול יריית תותח נשמע ממבצר סט. אנג'לו ומבשר שבריחתו של אנג'לוטי נתגלתה. קוורדוסי מחליט ללוות את ידידו אל מקום המחבוא בביתו. השמש חוזר לכנסייה ומספר לחברי המקהלה שנפוליאון הובס בקרב במרנגו, והניצחון יוחג בביצועה של קנטטה עם הזמרת פלוריה טוסקה בארמון פרנזה ובתפילת ההודייה טה דאום בכנסייה.
מפקד המשטרה, סקרפיה, המתחקה על עקבותיו של אנג'לוטי, מגיע לכנסייה, חוקר את השמש ומגלה שיש קשר בין אנג'לוטי לבין הצייר, ובין ציור הדיוקן לבין אחותו של האסיר הנמלט. הוא גם מוצא בכנסייה מניפה שאיבדה אישה כלשהי. טוסקה שבה לכנסייה להודיע לקוורדוסי, שלא יחכה לה בביתו, כי עליה לשיר בערב בקונצרט בארמון, אלא שקוורדוסי איננו, וחשדה מתעורר שוב, בייחוד לאחר שסקרפיה מציג לפניה את מניפתה של המרקיזה. טוסקה יוצאת בסערה אל ביתו של קוורדוסי, וסקרפיה שולח בעקבותיה את אחד מאנשיו, הסוכן ספולטה. בינתיים מתחילת תפילת ההודייה, ושעה שהמקהלה מבצעת את ה"טה דאום", חולם סקרפיה כיצד יתמלאו כל משאלותיו: הוא יזכה בטוסקה ויוציא להורג את אהובה.
מערכה שנייה
בחדרו, בארמון פרנזה, סקרפיה עדיין נתון כל כולו למחשבות על טוסקה וקוורדוסי. הוא כותב פתק ומצווה על אחד מסוכניו, שרונה, למסרו לידי טוסקה, כאשר תגיע לקונצרט בארמון. הסוכן ספולטה שב מחווילתו של קוורדוסי, ומודיע שלא מצא שם זכר לאנג'לוטי, אך, לעומת זאת, הוא מפייס את מפקדו בהודעה, שעצר את הצייר. סקרפיה פוקד להביא אליו את קוורדוסי לחקירה. אך הצייר מכחיש כל קשר לאנג'לוטי.
הקונצרט מסתיים ואל חדרו של ראש המשטרה מכניסים את טוסקה. הוא מצווה לכלוא את הצייר החשוד באחד החדרים הסמוכים, וחוקר אותה. גם היא אינה מגלה דבר, אך כאשר סקרפיה מספר לה שמנסים לחלץ מאהובה, קוורדוסי, בעינויים את סוד המחבוא, היא נשברת ומגלה לסקרפיה היכן מסתתר האסיר הנמלט. בינתיים נכנס שרונה ומודיע שהתקפת הנגד של נפולאון במרנגו הוכתרה בהצלחה. קוורדוסי פורץ בקריאות שמחה, וסקרפיה רואה בכך עילה מספקת להוציאו להורג. הוא פוקד להוציאו מן החדר.
טוסקה מתחננת בפני סקרפיה שיחוס על חיי אהובה, והוא מתנה את הסכמתו בהיענותה לחיזוריו. אותה שעה נכנס ספולטה ומבשר שאנג'לוטי שלח יד בנפשו, אחרי שהבין כי נתגלה מקום מחבואו. הוא מבקש הוראות מה לעשות בקוורדוסי, וסקרפיה אומר לטוסקה, שגורלו של הצייר תלוי עתה רק בה. אם תיענה לו, יביים את הוצאתו להורג. טוסקה נענית בחיוב, וסקרפיה פוקד על ספולטה לנהוג "כמו במקרה קודם". טוסקה דורשת מסקרפיה שיתן לה ולקוורדוסי אישור יציאה מרומא, ושעה שסקרפיה כותב את האישור, היא מבחינה בסכין המונחת על שולחנו. סקרפיה מחבק אותה והיא תוקעת את הסכין בלבו.
מערכה שלישית
שחר עולה על מבצר סט. אנג'לו. מרחוק נשמעת שירתו של נער רועה. פעמוני הכנסיות מבשרים את תפילת המיסה, וקוורדוסי מוסר לסוהר ששיחד מכתב אחרון שכתב לטוסקה. אלא שטוסקה מגיעה לפתע, ובידה אישור המעבר. שניהם קוראים את הכתוב בו בהתלהבות. טוסקה מגלה לאהובה כיצד הרגה את סקרפיה ומבקשת ממנו לשתף פעולה עם החיילים, כי הוצאתו להורג - מבוימת. כיתת חיילים נכנסת. הם יורים בקוורדוסי ויוצאים. רק אז מגלה טוסקה, שסקרפיה הוליך אותה שולל. הוא לא התכוון כלל לחוס על חיי הצייר. בינתיים מתגלה גם גופתו של מפקד המשטרה, והחיילים אצים לעצור את טוסקה, אלא שהיא מקדימה אותם וקופצת מן החומות אל מותה.
