לפני עלות המסך
אליזבת בדרכה לספרד, והיא מבטיחה לאזרחי צרפת הסובלים כי השלום הגיע. קרלו מברך אותה
והשניים מתאהבים זה בזו ממבט ראשון. כאשר מגיעות החדשות כי אליזבת צריכה להינשא
לאביו של אהובה, היא מסכימה למען טובת בני עמה והשלום המיוחל, בעוד קרלו נותר מתוסכל.
מערכה ראשונה
תמונה ראשונה
דון קרלו, בנו של פיליפ השני מלך ספרד, מגיע למנזר סט. ז'וסט בו נמצא הקבר של קרל החמישי,
מתוך מטרה לפגוש את אליזבת דה ולואה, אישתו של אביו, העתידה לבקר במקום עם בעלה.
קרלו מתוודה בפני חברו הטוב רודריגו, מרקיז פוזה, כי הוא אוהב את אליזבת, אך רודריגו משנה
את הנושא ומשכנע את קרלו לעזוב לפלנדריה מתוך מטרה לעזור להמונים העשוקים שם.
תמונה שנייה
הנסיכה אבולי מחכה למלכה בגן מחוץ למנזר עם כמה מבנות הלוויה שלה. רודריגו מגיע ומבקש
מאליזבת כי תעזור לקרלו לקבל את הסכמת פיליפ לצאת לפלנדריה. אליזבת נשארת לבדה וקרלו
מגיע לפגוש אותה, אך היא מצניעה את רגשות האהבה האמיתיים שלה ונשארת נאמנה לתפקידה
כמלכה. פיליפ המגלה את המלכה לבדה, זועם ומגרש את בת הלוויה האחראית, רוזנת ארמברג, מהחצר. רודריגו לוחץ על המלך להעניק חופש לאנשי פלנדריה, והמלך המתרשם ממנו פותח בפניו את לבו ומתוודה על חששותיו כי המלכה וקרלו מאוהבים. פיליפ מזהיר את רודריגו מפני האינקוויזיטור הגדול.
מערכה שנייה
תמונה ראשונה
לקראת חגיגות ממלכתיות אליזבת מעדיפה להעביר את הלילה בתפילה לבדה ונותנת לאבולי
את המסכה והמנטילה שלה ומבקשת ממנה להעמיד פנים כאילו היא המלכה. קרלו מחכה
לפגישה נוספת עם אליזבת וכאשר אבולי, המאוהבת אף היא בקרלו, מגיעה במקומה לפגישה,
קרלו מצהיר על אהבתו. כאשר אבולי מבינה כי קרלו ואליזבת הם נאהבים, היא מאיימת לגלות
זאת למלך. גם רודריגו אינו מצליח להרגיע את זעמה של אבולי ורודריגו משכנע את קרלו כי
ייתן לו את המסמכים הסודיים הקשורים לשחרורם של בני פלנדריה מהעול הספרדי.
תמונה שנייה
קהל רב מתרכז בכיכר המרכזית לקראת האוטו-דה-פה בו יישרפו על המוקד קבוצה של כופרים
שנתפסו על ידי האינקוויזיציה. קרלו מגיע עם קבוצה של נציגים מפלנדריה ומבקש מהמלך רחמים
ומחילה ואת האפשרות להשיב את השלום לארצם. פיליפ מסרב ואז קרלו דורש מאביו כי ייתן לו את השלטון על פלנדריה. כאשר פיליפ שוב דוחה אותו, קרלו שולף את חרבו ונשבע כי יגן על פלנדריה בכל מחיר. המלך הזועם מצווה כי קרלו יניח את נשקו אך הוא מסרב ואף אחד מחיילי המלך אינו מוכן לגשת לנסיך ולקחת את חרבו. רק רודריגו עושה זאת ובתמורה פיליפ מעניק לו תואר דוכס. האוטו-דה-פה נמשך וקול מלאכי מהמרומים מנחם את האנשים הנשרפים על המוקד.
מערכה שלישית
תמונה ראשונה
פיליפ מיואש כי מעולם לא הצליח לזכות באהבתה של אליזבת. האינקוויזיטור הגדול נכנס
ומרגיע את פיליפ כי אם מדובר בטובתה של הכנסייה אין לו כל התנגדות כי קרלו ירצח. אבל
האינקוויזיטור מתעקש כי רודריגו מהווה סכנה גדולה יותר ואם פיליפ ימשיך להגן על כופר
הוא יצטרך לתת את הדין על כך. אליזבת נכנסת מוטרדת לאחר שגילתה כי תיבת התכשיטים
שלה נגנבה מבלי לדעת כי אבולי עשתה זאת ומסרה אותה לפיליפ. כאשר המלך מצווה על
אשתו לפתוח את התיבה והיא מסרבת, הוא עושה זאת בעצמו ומגלה בתוכה תמונת דיוקן
של קרלו. פיליפ מאשים את אליזבת בבגידה והיא מתעלפת. רודריגו ואבולי נכנסים במהירות
ובעוד רודריגו מבין כי עליו לעשות עתה הכל להציל את קרלו, אבולי מתוודה בפני המלכה על
גניבת תיבת התכשיטים וגם על היותה הפילגש של המלך. אליזבת מגרשת את אבולי מהחצר
ודורשת ממנה לבחור בין גלות למנזר. אבולי נשבעת כי לפני עזיבתה היא תציל את קרלו.
תמנוה שנייה
רודריגו מגיע לכלא בו קרלו אסור ומתחנן בפניו כי יעשה כל שיוכל להציל את בני פלנדריה. הוא
מגלה לקרלו כי הוא מסר את המסמכים הסודיים למלך ולכן מותו שלו כתוצאה מכך הוא בלתי
נמנע. שני אנשים מגיעים לבית הכלא ויורים ברודריגו. לפני מותו הוא אומר לקרלו כי אליזבת תגיע
למנזר למחרת. פיליפ מגיע אף הוא ומשיב לקרלו את חרבו, אבל קרלו מפנה עורף לאביו, האחראי
על רצח חברו הטוב. ההמון מנסה לפרוץ לבית הכלא ולשחרר את קרלו, אך האינקוויזיטור הגדול
מגיע ומרגיע את המצב בעוד אבולי מנצלת את ההמולה ועוזרת לקרלו להימלט.
מערכה רביעית
ליד קברו של קרל החמישי אליזבת ממתינה לקרלו ומאחלת לו הצלחה במשימה המיועדת
בפלנדריה. השניים מבטיחים זה לזו להיפגש בעולם שכולו טוב יותר. פיליפ והאינקוויזיטור
הגדול מפתיעים אותם. המלך מצווה לאסור את קרלו.